Elektroforeesi on yksi molekyylibiologian eniten käytetyistä työkaluista. Sitä käytetään nukleiinihapon erottamiseen. Elektroporaatio on prosessi, jolla nukleiinihappo erotetaan koon perusteella. Elektroforeesissa käytetään geeliä. Geeliin tehdään kuoppia, joihin ladataan nukleiinihapponäytteitä. Sähkövirta kulkee ja nukleiinihapon koon mukaan geelissä liikkuu. Se auttaa määrittämään, erottamaan ja puhdistamaan nukleiinihapon.
Agaroosi vs polyakryyliamidi
Ero agaroosin ja polyakryyliamidin välillä on, että agaroosia käytetään suurten DNA-fragmenttien erottamiseen, mutta polyakryyliamidigeeliä käytetään erottamaan lyhyempiä proteiini- ja nukleiinihappofragmentteja. Agaroosi kaadetaan vaakasuoraan, kun taas polyakryyliamidi kaadetaan pystysuoraan. Agaroosia voidaan lämmittää ja kaataa vaakatasossa, mutta se rikkoutuu helposti, joten sitä on käsiteltävä varovasti.
Agaroosigeeliä käytetään yleisimmin elektroforeesin suorittamiseen. Koska se auttaa erottamaan nukleiinihappoja koon perusteella, sitä käytetään tuntemattoman DNA- tai RNA-näytteen tunnistamiseen. Tässä käytetään tunnetun kokoisia tikkaita ja tuntemattoman nukleiinin vyöhykettä verrataan tikkaisiin ja koko tunnistetaan.
Polyakryyliamidigeelielektroforeesia kutsutaan PAGE:ksi. Sitä käytetään yleisesti proteiinien erottamiseen niiden koon perusteella. Tämä elektroforeesi perustuu periaatteeseen, että varautunut proteiini- tai nukleiinihapponäyte kulkee geelin läpi, kun sähkökenttä tarjotaan. Koska biologisen molekyylin liikkuvuus muuttuu koosta ja varauksesta riippuen. Käytetty näyte tulee käsitellä tasaisen latauksen saavuttamiseksi siten, että liikkuvuus riippuu pohjimmiltaan koosta.
Agaroosin ja polyakryyliamidin vertailutaulukko
| Vertailuparametrit | Agaroosi | Polyakryyliamidi |
| Myrkyllisyys | Ei myrkyllistä | Hieman myrkyllistä |
| Huokosten koko | Suuremmat huokoset | Pienemmät huokoset |
| Käyttää | Agaroosigeeliä käytetään enimmäkseen DNA:n ja RNA:n erottamiseen | Polyakryyliamidigeeliä käytetään proteiinien erottamiseen ja sen kvantifiointiin |
| Geelin kaatoasento | Vaaka-asento | Pystysuora asento |
| Väriaine | Etidiumbromidi | Bromifenolisininen |
| Uudelleenkäyttö | Agaroosi voidaan sulattaa ja käyttää uudelleen | Sitä ei tavallisesti käytetä uudelleen |
Mikä on Agarose?
Agaroosi on biomolekyyli, jota käytetään luomaan geeli, joka on kolmiulotteinen matriisi, jossa on huokosia ja kanavia. Kolmiulotteinen matriisi on koossa vetysidokset. Koska siellä on vetysidoksia, matriisirakenne voidaan denaturoida helposti kuumentamalla. Näytteen biomolekyylit liikkuvat huokosten läpi.
Agarin sulamislämpötila on 85-95 celsiusastetta ja geeliytymislämpötila 35-42 celsiusastetta. Agaroosigeeli valmistetaan sekoittamalla agaroosi veteen ja sulattamalla se. Sitten se kaadetaan vaakatasossa muottiin, johon asetetaan kampa. Sitten agaroosi jäähtyy ja muodostaa geelin. Kampa jättää kaivon, johon näyte voidaan ladata.
Vähäpitoinen agaroosigeeli hajoaa helposti. Joten sitä on käsiteltävä varoen. Agaroosia voidaan käyttää DNA:n ja RNA:n erottamiseen. Agaroosigeelin huokoset ovat paljon suurempia, jotta bakteriofagi pääsee sisään. Agaroosi on polymeeri, jossa on pyruvaatti- ja sulfaattiryhmiä. Koska nämä ryhmät ovat negatiivisesti varautuneita, se aiheuttaa veden virtauksen vastakkaiseen suuntaan kuin DNA:n liike.
Väriaine etidiumbromidia käytetään DNA:n värjäämiseen, mikä muuttaa näytteen kokoa ja varausta. Puskuriliuos kaadetaan laitteistoon ja johdetaan virtaa, joka saa näytteen liikkumaan agaroosigeelin läpi ja muodostamaan juovia.
Mikä on polyakryyliamidi?
Polyakryyliamidi on synteettinen lineaarinen polymeeri, joka koostuu akryyliamidista ja akryylihaposta. Polyakryyliamidi imee vettä aktiivisesti ja muodostaa pehmeän geelin. Se on yksi elektroforeesissa käytetyistä geeleistä. Proteiini ja nukleiinihappo voidaan kvantifioida polyakryyliamidigeelissä niiden elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella.
Akryyliamidihydrataatiolla valmistettu polyakryyliamidigeeli on hyvä, koska huokoskokoa voidaan säätää hydrataatiosta riippuen. Pienen huokoskoon omaava geeli on tehokas pienempien molekyylien tutkimiseen. Suuremmat molekyylit eivät voi liikkua pienten huokosten läpi ja jäädä loukkuun, kun taas pienemmät molekyylit liikkuvat helposti huokosten läpi ja muodostavat nauhoja.
Polyakryyliamidigeeliä käytetään enimmäkseen SDS PAGE -kokeessa. SDS PAGE laajenee natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa. Sitä käytetään proteiininäytteiden erottamiseen niiden koon perusteella. Natriumdodekyylisulfaatti on pesuaine ja se sitoutuu proteiinimolekyyliin. Sitoutuessaan proteiiniin tämä pesuaine tuhoaa proteiinin sekundaarisen ja tertiaarisen rakenteen ja tekee siitä lineaarisen polypeptidiketjun. Tämä lineaarinen polypeptidi on negatiivisesti varautunut ja kulkee kohti anodia, kun siihen kohdistuu sähkökenttä. Tässä molekyylin kulkema matka on kääntäen verrannollinen molekyylipainon logaritmiin. Sitä käytetään myös alhaisen molekyylipainon omaavien nukleiinihapponäytteiden tutkimiseen.
Tärkeimmät erot agaroosin ja polyakryyliamidin välillä
Johtopäätös
Agaroosi ja polyakryyliamidi ovat kaksi eri polymeeriä. Ne ovat kemiallisesti erilaisia. Vaikka niitä molempia käytetään elektroforeesiin, niitä käytetään kahteen eri tarkoitukseen. Agaroosilla on suuremmat huokoset, ja sitä käytetään erottamaan suurempia nukleiinihappomolekyylejä, kuten DNA ja RNA. Toisaalta polyakryyliamidilla on pienemmät huokoset, ja sitä käytetään erottamaan ja määrittämään proteiineja, joilla on pienempi molekyylipaino.
Molemmat yhdisteet palvelevat eri tarkoituksia ja ovat erittäin hyödyllisiä molekyylibiologiassa. Molekyylibiologian lisäksi niitä käytetään myös monilla muilla aloilla. Koska nämä geelit auttavat määrittämään nukleiinihapon ja proteiinin määrän, niillä on käyttöä lääketieteessä ja oikeuslääketieteessä.
